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微量分光光度計的校準方式
點擊次數:492 發布時間:2018-10-23

引言 微量分光光度計的出現解決了微量樣品采用分 光法定性及定量測試的問題。基于此特點,該類儀 器被廣泛用于生物、醫學等檢測樣本量并且價 格昂貴的領域。微量分光光度計屬于分光光度計類 測試儀器,遵循朗伯比爾定律,但較普通的分光光 度計還是有很大的改進。隨著儀器使用量的增多, 不得不考慮該類儀器的溯源性問題。2015 年相關部 門提出并計劃編制該類儀器的校準規范,但至今還 未出版正式的國家校準規范。本文針對微量分光光 度計的測試原理和功能特點,分別對兩種校準方式 進行了探討,并提出了建議。


 1 微量分光光度計的測試原理及功能特點 微量分光光度計的獨特之處在于它對測試樣品量 的要求非常低,現有的儀器中可測量低為 0.3 μL 的 樣品,可以節省非常且昂貴的樣品量。檢測波 長范圍 200 ~ 1 000 nm,多數儀器設定了定點測試 波 長 230 nm、260 nm 和 280 nm, 便 于 DNA、RNA 和蛋白質的測試。采用發光穩定且不需預熱的氙燈 代替鎢燈和氘燈作為光源,壽命更長,光強更大。 該類儀器中精度稍高的都在使用電感耦合陣列檢測 器(CCD),其光譜范圍、量子效率、信噪比等指標 都遠高于光電二極管陣列。 使用該類儀器多用其基座檢測模式,該功能是 實現微量測試的關鍵技術。即,用微量移液槍吸取 樣品滴加在檢測基座上,基座上包埋了一根接受光 纖,放下檢測臂與液體接觸,檢測臂上有檢測光纖, 應用液體的表面張力在檢測基座和檢測臂之間自動 形成標準液柱。液柱高度相當于光程,液柱高度可 設定為 0.05 nm、0.1 nm、0.5 nm 等。光源發出的光與普通的分光光度計相比,從點樣到測試完成 的時間大大縮短,且省去了清洗比色皿的程序。該 檢測基座只需用拭鏡紙擦拭即可。該類儀器可以實 現的檢測功能如下:普通的紫外 - 可見分光光度計 檢測、DNA/RNA 濃度檢測、蛋白質濃度檢測等。

2 微量分光光度計的校準方法分析 通過查閱資料,現有的微量分光光度計普遍具 有的技術參數,如表 1 所示。 與普通的分光光度計比較,一些基本的技術參數還是比較一致的。但是該類儀器預設了 DNA、 RNA、蛋白質、熒光染料吸光度值與濃度的對應關系, 所以可以直接給出這些樣品的濃度值。根據以上技 術參數及測試原理,對微量分光光度計的校準就有 兩種思路, 一是從分光光度計的原理參照普通分光 光度計的檢定規程 JJG 178-2007《紫外、可見、近 紅外分光光度計》來校準,另一種思路是從該類儀 器的測量結果入手,以濃度標準物質來校準其測量 值的示值誤差等。下面對兩種思路做分析對比,并 給出合理建議。 

2.1 以濾光液標準物質進行校準 該方法可以參照 JJG 178-2007 進行部分項目的 校準。可將波長準確性、波長重復性、吸光度準確 性、雜散光等儀器主要關鍵的技術指標列為校準項 目。對波長準確性和波長重復性的校準可以使用現 有的氧化鈥波長溶液標準物質,該標準溶液在波長 240 ~ 650 nm 范圍有 10 個以上尖銳、峰位明確的吸 收峰。吸光度的準確性可以使用 JJG 178-2007 給出 的方法,配制一定濃度的重鉻酸鉀高氯酸溶液或重 鉻酸鉀硫酸溶液,用高精度的紫外可見風光光度計 定值其在 235 nm、257 nm、313 nm、350 nm 處的吸 光度值。通常是在光程為 10 mm 定值,使用時可根 據朗伯比爾定律 A = - kLc 來轉換更小光程時的吸光 度值,當儀器給出的是標準為光程 10 mm 的吸光值 時則不需要將標準值換算即可進行比較。其次要注 意校準時環境溫度與定值時溫度的匹配性。雜散光 特性可以根據 JJG 178-2007 的要求使用 10 g/L 的 溶液和 50 g/L 的亞硝酸鈉分別在 220 nm 和 340 nm 處檢測儀器的透光率或吸光度值。以上校準 方式和項目是基于微量分光光度計的測量原理,結 合生產商給出的技術參數,使用者可以利用校準結 果對被校儀器有一個綜合的評價。此外,如果希望進一步了解儀器的基線平直度和基線噪聲等指標也 可參照 JJG 178-2007 來制定校準方法。 

2.2 以濃度標準物質進行校準 該方法是在微量分光光度計可以直接測定核酸 和蛋白質類物質的含量值基礎上,以 DNA 標準物 質、RNA 標準物質或蛋白質標準物質來測定標準物 質的測量值與標注值之差作為儀器的示值誤差來評 價儀器的計量特性。該類儀器預設了定點波長測試 功能,并且預設了吸光度值與濃度值的關系。核酸 和蛋白質的大吸收波長 260 nm、280 nm,為了判 斷核酸或蛋白質的純度還增加了 A230 nm 用來表示 樣品中存在的一些污染物如碳水化合物、苯酚、多 肽等,A320 nm 用來表示樣品的渾濁度和其他干擾 因子。用濃度標準物質來校準該類儀器還可以將測 量值的重復性和儀器的線性納入校準項目,當然儀 器線性的評價需要用到不同濃度的系列標準溶液。 3 結語 綜合上述分析,種校準方式在稍加細化的 基礎上即可以開展校準工作,且對于廣大的計量工 作者來講比較容易上手,標準物質價格較低且容易 獲得。而后一種校準方式雖然可以給出微量分光光 度計的測量結果的示值誤差、線性等計量特性優劣, 但在實際校準過程中如何選定標準物質,僅單一標 準物質還是核酸類和蛋白質類共同使用,因為兩者 是在不同的吸收波長下進行定量測量,考查的是不 同波長下濃度測量的準確性。而且還需要考慮 DNA 或 RNA 標準物質及蛋白紙標準物質的穩定性、經 濟性和易獲得性,且對存儲條件的要求不能太高, 尤其是有些 DNA 含量標準物質的存儲溫度要求較 低,不便于計量工作人員進行現場校準。所以在 JJG 178-2007 的基礎上研制一套系列標準液,對該類儀 器的波長準確性、吸光度準確性、雜散光等計量特 性進行校準,通過校準結果可以客觀、全面地評價 儀器的技術指標,給使用者了解該儀器提供更加綜 合的數據。

 

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