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日立 F - 4500 型熒光分光光度計的調試及應用
發布時間:2018-11-08 點擊次數:736次

熒光法因其具有靈敏度高、選擇性強、用樣量少、方法簡便等優點,現已廣泛應用于食品檢驗、化 學、醫學、藥物分析、冶金、生命科學和環境科學等各個領域。簡單介紹了日立 F - 4500 型熒光分光光度計 的基本結構,對其波長掃描的調試方法做了詳細介紹。

真人百家家乐熒光分光光度計是一種用來掃描液相熒光標記 物所發出的熒光光譜的常用儀器。它不僅能提供發 射光譜、激發光譜,而且能提供熒光強度、量子產率、 熒光壽命以及熒光偏振等多種物理參數,可以從各 個角度反映分子的成鍵以及結構情況。通過對這些 參數的測定,不但可以對樣品做定量分析,而且還 可以推斷出分子在不同環境下的構象變化,從而闡 明分子結構與功能之間的關系。熒光光譜法有諸多 優點,如靈敏度高、選擇性強、用樣量少、方法簡便、 工作曲線線形范圍寬等,所以熒光分光光度計可以 廣泛應用于食品檢驗、地理、化學、醫學、藥物分析、 冶金、生命科學和環境科學等各個領域[1 - 12]。日立 F - 4500 型熒光分光光度計的激發波長掃描范圍一 般是 200nm ~ 900nm,發射波長掃描范圍是 200nm ~ 900nm,可用于液體、固體樣品的光譜掃描。該儀器 采用的分析方法一般包括波長掃描、時間掃描、光度 值法、三維掃描。現就波長掃描方法的調試做一 介紹。 1 儀器的基本結構 ( 1) 激發光源: 高壓汞蒸氣燈或者氙弧燈,其中 氙弧燈能發射出強度較大的連續光譜,波長范圍在 300nm ~ 400nm ,且強度幾乎相等,所以常用氙弧燈 作激發光源。 ( 2) 激發單色器: 位于光源和樣品室之間,又叫 單色器,用于篩選出特定的激發光譜。 ( 3) 發射單色器: 位于樣品室和檢測器之間,也 叫第二單色器,常用光柵作為單色器。用于篩選出 特定的發射光譜。 ( 4) 樣品室: 通常情況下,液體樣品用石英池, 粉末或片狀樣品用固體樣品架。測量液體時,讓光 源與檢測器成直角; 測量固體時,讓光源與檢測器成 銳角。 ( 5) 檢測器: 一般用光電管或光電倍增管作檢測器。其作用是將光信號放大并轉為電信號。 2 開機前的準備 ( 1) 實驗室溫度應保持在 15℃ ~ 30℃ 之間,濕 度應保持在 45% ~ 70% 之間。 ( 2) 確認樣品室內無樣品,安裝好所使用的樣 品池架,關上樣品室蓋。 ( 3) 準備好四面透明的石英比色皿。 3 調試方法 ( 1) 打開電腦主機電源。 ( 2) 打開電源開關( POWER→ON) ,等待儀器風 扇運轉正常。 ( 3) 間隔 10 秒后,按下氙燈的點燈按鈕( LAMR START) ,令黃燈亮起( 注意按鈕時間不能超過 20 秒) 。如果使用外接激發光源,不用操作該步驟。 ( 4) 當黃燈亮起不熄滅時,等待 5 ~ 10 分鐘,打 開主板電源( MAIN→ON) 。 ( 5) 點擊 FL solutions 圖標,打開儀器工作程序 窗口,等待儀器自檢。 儀器自檢完畢后,開機工作完成,然后進行分析 方法的編輯與樣品測試。 4 分析步驟 所謂波長的掃描,就是固定激發波長掃描熒光 強度隨發射波長的變化關系,或者是固定發射波長 掃描熒光強度隨激發波長的變化關系。其分析方法 ( Method) 包括 6 個選項,可以根據實驗要求具體選 擇。 點擊右側快捷欄的“Method”后,立即顯示了分 析方法( Analysis Method) 的 5 個重疊界面,分別為 General( 常規) ,Instrument( 儀器條件) ,Monitor ( 模 擬監 視) ,Processing ( 處 理 方 法) ,Report ( 報 告 格式) 。 4. 1 “常規 ( Genernal) ”選項的編輯 Measurement 選擇 Wavelength scan; Operator 輸 入操作者姓名; Instrument 自動給出,Sampling 中輸 入樣品名稱; Comments 輸入對樣品的簡要說明,也 可不輸入; Load 調用已經存入的條件,一般不用; Save 保存現在的條件或 Save As 將現在的條件另 存為。 4. 2 “儀器條件( Instrument) ”選項的編輯 Scan mode( 掃描方式) 有兩種: Emission( 發射) 和 Excitation ( 激 發) ,Data mode ( 數 據 方 式) 選 擇 Fluorescence( 熒光采集) 。EX WL 輸入激發波長,EM Start WL 輸入發射光譜掃描的開始波長,EM End WL 輸入發射光譜掃描的結束波長,EM WL 輸 入發射波長,EX Start WL 輸入激發光譜掃描 的開始波長,EX End WL 輸入激發光譜掃描的結束 波長,Scan speed 選擇掃描速度,一般選擇 240,Delay 選 0,EX 和 EM 分別為激發單元和發射單元的狹 縫,一般情況下選 5. 0 即可。PMT Voltage 為光電管 電壓選擇,有 400V,700V,950V 三個值,一般選擇 700V。Response 為響應速度,一般選擇 2. 0s,速度 快則峰形分辨率高,但噪音大,速度慢則反之。選中 Shutter control,Replicates 設為 1。 如果是已知激發波長和發射波長的樣 品,按照上述方法輸入測試條件即可。實際掃描時, 若激發波長為 λex ,則掃描范圍一般為 λex + 20 ~ 2λex - 20 ,并且 2λex - 20 ≤ 900nm ; 若發射 波長為 λem ,則掃描范圍一般為 λem /2 + 20 ~ λem - 20,并且 λem - 20 ≤ 900nm 。 如果是未知條件的樣品可先選擇發射( Emission) 模式,在 EX WL 處輸入一個范圍在 200nm ~ 300nm 內的激發波長,先預掃描發射光譜,記錄下峰 值波長 λem ; 然后選擇激發( Excitation) 模式,在 EM WL 處填入 λem 的值,掃描激發光譜,記錄下激發光 譜的峰值波長 λex ; 然后用該值 λex 再一次在發射模 式下掃描發射光譜,重復上面的過程,直到所得到的 兩個峰值波長不發生變化為止。這時得到的兩個峰 值波長即為激發波長和發射波長。 4. 3 “模擬監視( Monitor) ”選項的編輯 Y Axis Max 的數值在樣品預掃描后儀器自動賦 值,Y Axis Min 需要根據具體情況手動賦值。Open data processing window after data acquisition( 測量后 打開數據處理窗口) 選中后測量結果可自動保存, 一般選中。Print report after data acquisition 選中后 數據采集后自動打印,一般不選。Overlay( 重疊光 譜圖) 選中后掃描時可將光譜圖重疊在監視畫面 上,但重復掃描不可設定,一般選中。實際掃描時, 該選項一般不用編輯。 4. 4 “處理方法( Processing) ”選項的編輯 此界面主要是對已經測定的圖譜根據用戶的要 求進行選擇處理。 CAT( 平均化) ,選中時儀器會對重復測定的圖 譜進行平均處理。 Processing( 處理方法的選擇) ,共有 4 種處理方 法: Savitsky - Golay Smooth ( Savitsky - Golay 平 滑) ,Mean Smooth ( 平均平滑) ,Median Smooth ( 中間平滑) ,Derivative ( 微分求導) 。Peak Finding ( 峰 檢 出) 共 有 3 項 內 容,Integration ( 檢 出 方 法) 、 Threshold( 閾值) 和 Sensitivity( 靈敏度) 。其中 Integration 包 括 Rectangnlar ( 矩 形) 、Trapezoid ( 斜 方 形) 和 Romberg ( 龍伯格) 三種檢出方法; Threshold 可決定信號峰的取舍,賦值范圍為 0. 001 ~ 1000,小 于賦值的峰可以顯示但不打印結果; Sensitivity 可改 變放大器的放大倍數。一般設置為 1。 4. 5 “報告格式( Report) ”選項的編輯 報告格 式 共 有 Output ( 輸 出) 、Orientation ( 方 位) 、Pintable items( 打印選項) 和 Printer Font( 打印 機字形) 。其中 Output 包括 3 種可選格式: Print Report 打印報告、Use Microsoft Excel 將數據變換為微 軟 Excel 格式、Use print generator sheet 利用變換器 ( 附選件) 打印圖表; 選中 Include data、Include method、Include graph、Include data listing、Include peak table、Peak WL /Peak data、Start WL /End WL、Valley WL /Valley data、Peak Area。 該選項需要注意的是,Date 輸入光譜橫坐標的 數據點間隔一般為 0. 2,Date start 和 Data end 的數 據一般要與 Instrument 中設置的 EM( Ex) Start WL 和 EM( EX) End WL 一致,否則激發光譜或發射光 譜掃描完后輸出的文本( txt) 文件的波長范圍與圖 譜文件( 擴展名為 FDS) 的波長不一致,而無法用其 他軟件對結果進行處理分析。這一點在操作時容易 被忽視,所以要注意。 4. 6 運行儀器測量樣品 將待測溶液倒入石英比色皿,用吸水紙將石英 比色皿外側的溶液拭去,打開樣品室蓋,將石英比 色皿放入樣品室中,蓋好蓋子。點擊右側的 Measure 按鈕,儀器開始測量。測量完成后,打開數據處理 窗口,點 File 菜單中的 Save as 保存圖譜文件,選擇 路徑并 設 置 文 件 名 后 保 存 圖 譜 文 件 ( 擴 展 名 為 FDS) ,用同樣的方法保存一個與圖譜文件相同文件 名的文本( 擴展名為 txt) 文件,將設置的參數保存 下來。 4. 7 關機順序 將石英比色皿從樣品室中拿出并清洗干凈。退 出所有程序,關閉電腦。關閉光度計主開關( MAIN →OFF) 。當電源開關關閉后 5 秒鐘,再次接通 10 分鐘,讓風扇工作,使燈室散熱,最后關閉電源開 關( POWER→OFF) 。 5 結語 熒光分光光度計屬于大型精密儀器,價格昂貴, 故障較難維修并且費用較高。所以,應嚴格按照正 確的順序操作,并定期進行維護和保養,否則將影 響激發光源的使用壽命,進而影響到整臺儀器的使 用壽命。目前熒光分光光度計的應用范圍越來越 廣,所以應操作熟練熒光分光光度計,以提高其利 用率。


 

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