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分光光度計比濁法測定抗菌物質效價
發布時間:2018-11-19 點擊次數:374次

真人百家家乐瓊脂擴散法是測定抗菌物質效價常用的方法,但人為操作因素常常影響實驗結果的準確性。實驗旨在 建立一種測定準確、操作簡單、無需特殊設備的分光光度計比濁法來測定各種抗菌物質的效價。研究發現,以抑 菌率最高時對應的培養時間為取樣時間點,在中等接種量下,在實驗濃度范圍內,細菌素 nisin、類細菌素 NFL 和 抗生素硫酸慶大霉素這 3 種抗菌物質的濃度與抑菌率之間的線性關系良好,R2 值均高于 0. 99,標準曲線成立。 該法適用于設備條件簡單的實驗室準確測定各類抗菌物質效價。

抗菌物質是指具有殺菌或抑菌活性的物質,包括 細菌素、類細菌素和抗生素等生物活性物質。在過去 的 60 多年里,多種能準確測定抗菌物質活性的方法 先后被提出,包括 ATP 生物發光測定法( ATP Bioluminometry) 、綠色熒光蛋白測定法( GFP bioassay) 、 MTT[3-( 4,5-dimethyl thiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide]比色法、免疫學方法等 [1 - 4],然而 使用這些方法需要特殊的試劑或儀器設備,因此沒有 得到廣泛應用。長期以來,瓊脂擴散法( agar diffusion assay) 因無需特殊材料,檢測成本低[5 - 6]而成為測定 抗菌物質活性最常用的方法,但是該法耗時耗力、對 操作人員經驗要求高、人為影響因素多,實驗者經常 得不到理想的實驗結果[7]。1952 年,Berridge 和 Barrett 應用微孔比濁法來測定抗生素效價[8],經過 幾十年的不斷改進,該法已以成為可以定量測定抗菌 物質的一種方法[9 - 10],但是,需要使用酶標儀這一 “短板”限制了其廣泛應用,如能建立起分光光度計 比濁法無疑將極大提高其應用普遍性。為此本研究 對于影響分光光度計比濁法準確定量抗菌物質效價 的關鍵因素進行了研究,建立了測定細菌素 nisin、類 細菌素 NFL[11]和抗生素硫酸慶大霉素等抗菌物質效 價的分光光度計比濁法。

1 材料與方法

真人百家家乐1. 1. 1 菌種 金黃桿菌( Chryseobacterium) NHW 菌株、乳酸乳 球菌( Lactococcus lactis) NFL 菌株和乳酸乳球菌( L. lactis) 8148 菌株,為安徽農業大學食品微生物實驗 室保藏。 1. 1. 2 培養基 STAA 培 養 基: 蛋 白 胨 20 g,酵 母 抽 提 物 2 g, K2HPO4 1 g,MgSO4·7H2O 1 g,甘油 15 g,瓊脂 13 g, 蒸餾水 1 000 mL,pH 7. 0 ± 0. 2,121 ℃下 15 min 滅菌 后冷卻至 40 ~ 50 ℃ 左右,加入過濾除菌的鏈霉素 500 mg,環己六亞胺 50 mg 和乙酸鹽 50 mg 混勻,用 于培養金黃桿菌 NHW 菌株。 MRS 培養基: 牛肉浸膏 8. 0 g,Tween-80 1. 0 mL, 葡萄糖 20. 0 g,胰蛋白胨 10. 0 g,酵母抽提物 4. 0 g, K2HPO4 2. 0 g,檸檬酸三銨 2. 0 g,醋酸鈉 5. 0 g,MnSO4·H2O 0. 05 g,MgSO4·7H2O 0. 2 g,蒸餾水 1 000 mL,pH 6. 0 ± 0. 2。用于培養乳酸乳球菌 NFL 菌株。 GM17 培養基: 補充了 15 g /L 葡萄糖的 M17 培 養基( 購自青島海博) ,用于培養乳酸乳球菌 8148 菌 株。 1. 2 實驗方法 1. 2. 1 抗菌物質抗菌類型的確定 乳酸乳球菌 NFL 發酵上清液的制備: 將活化后 的乳酸乳球菌 NFL 菌株以 5% 接種量接種于 MRS 液 體培養基中,30 ℃ 培養 12 h,離心( 10 000 r /min,15 min) 取上清液,將上清液過濾除菌,取濾液備用。 硫酸慶大霉素、氯霉素和類細菌素 NFL 抗菌類 型的確定: 將活化后的指示菌金黃桿菌 NHW 菌株以 5% 接種量接種于 STAA 液體培養基中培養至對數期,離心( 10 000 r /min,5 min) 取菌體,用生理鹽水洗 滌 1 次,將菌體重懸于生理鹽水中,分別添加終質量 濃度為 16. 67 μg /mL 的氯霉素乙醇溶液、888. 89 U / mL 的硫酸慶大霉素水溶液、66. 67 μL /mL 的 NFL 菌 上清液,30 ℃下振蕩 ( 150 r /min) 培養 6 h,分別在 培養的 0 時刻和 6 h 取 200 μL 發酵液涂布于 STAA 平板表面,30 ℃下培養測定菌落總數。 nisin 抗菌類型的確定: 將活化后的指示菌乳酸 乳球菌 8148 菌株以 5% 接種量接種于 GM17 液體培 養基中培養至對數期,離心( 10 000 r /min,5 min) 取 菌體,用生理鹽水洗滌 1 次,將菌體重懸于生理鹽水 中,添加終濃度為 1. 5 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液( 0. 02 mol /L) 。30 ℃下靜置培養 6 h,分別在培養的 0 h 和 6 h 取 200 μL 發酵液涂布于 GM17 平板表面,30 ℃ 下培養測定菌落總數。 1. 2. 2 不同抗菌物質抑菌率曲線的測定 將活化后的指示菌以 2% 的接種量接種于相應 的培養基中,實驗組分別加入終質量濃度為 16. 67 μg /mL 的氯霉素乙醇溶液 ( 對照為無水乙醇) 、 888. 89 U /mL 的硫酸慶大霉素水溶液( 對照為無菌 水) 、66. 67 μL /mL 的 NFL 菌株發酵上清液( 對照為 MRS 培養基) 和 0. 5 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液( 對照為 0. 02 mol /L HCl 溶液) ,培養過程中每隔 2 h 取樣,立 即轉入冰水浴中以終止微生物生長,于 600 nm 波長 處測定吸光值( 上海真人百家家乐,UV1800紫外可見分光光度 計) ,連續測定至 14 h。對照組加入量與實驗組體積 相同,其余方法同實驗組。 抑菌率/% = ( OD對照 - OD實驗) /OD對照 × 100 1. 2. 3 抗菌物質效價分光光度計比濁法的建立 1. 2. 3. 1 指示菌接種量對取樣時間點的影響 乳酸乳球菌 8148 接種量對 nisin 效價測定取樣 時間點的影響: 將活化后的乳酸乳球菌 8148 菌株分 別以 2% 、5% 、8% 的接種量接入 GM17 培養基,實驗 組中加入終濃度為0. 5 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液,分別 在 30 ℃下靜置培養 1、2、3 h,取樣,測定抑菌率和發 酵液濁度增量,濁度增量 OD600 = OD600實驗 - OD600起始。 金黃桿菌 NHW 接種量對類細菌素 NFL 效價測 定取樣時間點的影響: 將活化后的金黃桿菌 NHW 分 別以 1% 、2% 、3% 的接種量接入 STAA 培養基,實驗 組中加入終濃度為 66. 67 μL /mL 的 NFL 菌株發酵上 清液,分別在 30 ℃下振蕩培養 3、4、5 h 取樣,測定抑 菌率和發酵液濁度增量 OD600。 1. 2. 3. 2 測定抗菌物質效價標準曲線的建立nisin 效價標準曲線的建立: 將活化后的乳酸乳 球菌 8148 菌株以 5% 的接種量接入 GM17 培養基,實 驗組中加入終濃度為 0. 2、0. 5、0. 8、1. 1、1. 4 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液,在 30 ℃下靜置培養 2 h,取樣測定 抑菌率。另一實驗組中加入終濃度為 0. 4、0. 8、1. 2、 1. 6、2. 0、2. 4 U /mL 的 nisin 鹽酸溶液,在 30 ℃ 下靜 置培養 5 h,取樣測定抑菌率。 2 h 取樣的 nisin 效價標準曲線的驗證性實驗: 將 活化后的乳酸乳球菌 8148 菌株以 5% 的接種量接入 GM17 培養基,實驗組中加入終濃度為 0. 4、1. 0 U / mL 的 nisin 鹽酸溶液,在 30 ℃ 下靜置培養 2 h,取樣 測定抑菌率。根據標準曲線的回歸方程計算這兩個 樣品的測定誤差率( RSD) 。 RSD/% = 抑菌率( 實際) - 抑菌率( 擬合) 抑菌率( 實際) × 100 類細菌素 NFL 效價標準曲線的建立: 將活化后 的金黃桿菌 NHW 以 2% 的接種量接入 STAA 培養 基,實驗組中加入終濃度為 36. 67、43. 33、50. 00、 56. 67、63. 33 μL /mL 的 NFL 菌株發酵上清液,分別 在 30 ℃下振蕩培養 4 h,取樣測定抑菌率。測定終濃 度為 40、60 μL /mL 的 NFL 菌株發酵上清液的抑菌 率,用所得標準曲線的回歸方程計算這兩個樣品的測 定誤差率( RSD) 。 硫酸慶大霉素效價標準曲線的建立: 將活化后的 金黃桿菌 NHW 菌株以 2% 的接種量接入 STAA 培養 基,實驗組中加入終濃度為 444. 44、533. 33、622. 22、 711. 10、799. 99、888. 88 U /mL 的硫酸慶大霉素水溶 液,分別在 30 ℃ 下振蕩培養 4 h,取樣測定抑菌率。 測定終濃度為 577. 77、755. 55 U /mL 的硫酸慶大霉 素水溶液的抑菌率,用所得標準曲線的回歸方程計算 這兩個樣品的測定誤差率( RSD) 。 2 結果與分析 2. 1 不同抗菌物質的抑菌率曲線 從圖 1 可以看出,隨著指示菌在硫酸慶大霉素水 溶液中處理時間的延長,細胞逐步被殺死,失去生長 能力。而指示菌在 nisin、氯霉素和 NFL 菌株發酵上 清液中處理 6 h,活菌數下降幅度均很小,nisin 和氯 霉素是已知的抑菌劑,表明 NFL 菌株發酵上清液具 抑菌活性而非殺菌活性。 在指示菌培養基中分別添加以上各種抗菌劑 后,測定其生長曲線,計算得到抑菌率曲線。從圖 2 可見,抑菌類抗菌劑 nisin、氯霉素和 NFL 菌株發酵上

2 抗菌物質效價分光光度計比濁法的建立 2. 1 接種量對取樣時間點的影響 抑菌率計算的依據是生物量,而接種量的大小會 直接影響微生物細胞生物量的高低,因此研究了指示 菌接種量對取樣時間點的影響。從圖 3 可以看 出,中等( 5% ) 和較高( 8% ) 接種量下測定 nisin 濃度 的取樣時間點均為 2 h。低接種量( 2% ) 下,指 示菌培養 3 h 的抑菌率高于 2 h 的,導致測定 nisin 濃 度的取樣時間點延后。取樣時間點的確定 不僅取決于最高抑菌率,還要兼顧指示菌生長增量和 培養時間,如圖 3 所示,低接種量( 2% ) 下指示菌培 養 3h 的 對 照 組 ( 未 添 加 nisin ) 發酵液濁度增量 ( OD600 ) 很低,表明此時體系中的活菌量較低,不能很 好地表征 nisin 的抑菌效力,且培養時間偏長。因此, 以乳酸乳球菌 8148 為指示菌來測定 nisin 濃度指示菌接種量為 5% ,取樣時間點為 2 h。

2. 2 分光光度計比濁法測定抗菌物質效價的標準曲 線的建立 2. 2. 1 測定 nisin 效價標準曲線的建立 以 5% 接種量接種指示菌乳酸乳球菌 8148,在 GM17 培養基中添加不同終濃度的 nisin,培養 2 h,測 定抑菌率,以抑菌率對 nisin 濃度值進行線性回歸。 由圖 5 可知,在 nisin 終濃度為 0. 2 ~ 1. 4 U /mL,抑菌 率為 25% ~ 98% 的范圍內,nisin 濃度與抑菌率之間 呈良好的線性關系( R2 = 0. 9921) ,驗證性實驗( 表 1) 表明,該方法的準確度較高( RSD < 5% ) 。在非取樣時間點測得標準曲線回歸方程的 R2 值低于 0. 99,表明此時取樣測定所得數據的線性相關度偏
 

2. 2. 2 測定類細菌素 NFL 效價標準曲線的建立 乳酸乳球菌 NFL 菌株發酵上清液中含有類細菌 素 NFL,與 nisin 不同,NFL 菌株發酵上清液不是純 品,其中還含有未被細胞利用完的營養物質及代謝產 物,實驗發現,本比濁法同樣適用于發酵液中抑菌物 質活性的定量測定。以 2% 接種量接種指示菌金黃 桿菌 NHW 菌株,在 STAA 培養基中添加不同體積的 NFL 菌株發酵上清液,培養 4 h,測定抑菌率,以抑菌 率對 NFL 菌株發酵上清液添加量進行線性回歸。由 圖 6 可知,在 NFL 菌株發酵上清液添加量為 36 ~ 64 μL /mL,抑菌率為 7% ~ 58% 的范圍內,發酵上清液 添加量與抑菌率之間的線性相關良好( R2 = 0. 994) , 驗證性實驗( 表 2) 表明該方法的準確度較高( RSD < 5% ) 。

2. 2. 3 測定硫酸慶大霉素效價的標準曲線的建立 由圖 7 可知,nisin 測定取樣時間點( 2 h) 所 對應的時刻是實驗組( 培養基中含 0. 5 U /mL 的 nisin) 生長曲線的對數前期。如前所述,硫酸慶大霉素 的抑菌率曲線與 nisin 等抑菌劑的不同,并沒有呈現 明顯的峰值,但在 4 h 時抑菌率會處于一直較高的平 臺,此時對應的實驗組也基本處于對數前期。

3 討論 采用比濁法測定抗菌物質特別是抗生素效價的 文獻不少,方法大致都是將抗菌物質加入指示菌培養 體系中培養一段時間( 一般為 2 ~ 5h) 測定濁度,抗菌 物質濃度的對數與濁度在一定范圍內線性關系良好 ( R2 > 0. 99) [12 - 14]。但這些報道中均沒有說明抗菌 物質與指示菌培養時間( 即取樣測定濁度的時間點) 的確切依據。李秀蘭等采用分光度度計比濁法測定 抗菌肽活性,抗菌肽濃度與活力單位之間線性關系良 好,但是操作較為復雜,需要將對數期的指示菌菌體 洗滌后重懸于緩沖液中,加入抗菌肽樣品振蕩培養 30 min 后測定濁度,將所測結果代入經驗公式得到活 力單位[15]。同樣,作者也沒有說明為何要培養 30 min,這樣對于其他種類抗菌物質效價的測定,并不具 有直接的借鑒意義。 本研究所建立的比濁法是將抑菌率與抗菌物質 濃度之間直接建立線性相關,并且找到了抑菌劑和抗 菌劑效價線性定量測定的關鍵因子,即取樣時間點。 以 nisin 和硫酸慶大霉素的效價測定為例( 圖 5 和圖 9) ,如果取樣時間點選擇得不好,所得的標準曲線 R2 值就會小于 0. 99,達不到線性相關的要求。無論是 nisin 這種抑菌劑還是硫酸慶大霉素這種殺菌劑,取樣時間點對應的都是實驗組( 即培養基中加入 抗菌物質) 生長曲線的對數前期( 圖 7 和圖 8) ,這種 規律性可能是因為本法采用的抑菌率指標依據的是 對照組活細胞與實驗組中未被抑制或殺死的活細胞 生長能力的比較,當取樣時間點為實驗組的對數前 期,實驗組生物量基本可以反映當時的活細胞數; 如 果取樣時間點為實驗組的對數末期,實驗組生物量會 包含部分死細胞,就會偏離效價與抑菌率之間的線性 相關了。 除此之外,接種量的大小對抑菌率的高低有顯著 的影響( 圖 3 和圖 4) ,雖然低接種量下最高抑菌率值 較高,但取樣時間點會延后,且指示菌生長速度 偏低,并不能很好地表現出抑菌物質的作用; 高接種 量從檢測時間和最高抑菌率方面均較差,因此,接種 量的優化對于提高本方法的應用效果十分必要。 本研究所建立的分光光度計比濁法不僅可用來 準確測定 nisin、類細菌素 NFL 和慶大霉素的效價,而 且具有設備簡單、操作簡單等優點。有理由相信,本 方法也可以適用于其他抗菌物質效價的測定。首先, 測定抗菌物質抑菌率曲線,以此為依據,抑菌劑以最 高抑菌率對應的時間點為取樣時間點,殺菌劑可以結 合實驗組生長曲線和抑菌率曲線,綜合考慮實驗組對 數前期和抑菌率峰值選擇出合適的取樣時間點; 隨 后,測定指示菌不同接種量下的抑菌率,確定合適的 指示菌接種量; 最后,建立抑菌率與抗菌物質效價之 間的標準曲線。


 

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